舞台は恐怖政治が行われていた1800年のローマ。聖アンドレア・デッラ・ヴァッレ教会で絵を描いている画家カヴァラドッシは、脱獄してきた旧知のアンジェロッティを見つけ、かくまうことになります。そこへカヴァラドッシの恋人で歌姫のトスカがやって来ます。トスカは、彼の落ちつかない様子を見て、礼拝堂に来るアッタヴァンティ夫人（アンジェロッティの妹）と浮気をしているのではないかと疑い出します。警視総監スカルピアは、以前からトスカに横恋慕していて、なんとか恋敵を陥れるために巧みにトスカの嫉妬心を煽って、カヴァラドッシの隠れ家をつきとめます。カヴァラドッシは脱獄犯をかくまった罪で、ファルネーゼ宮殿のスカルピアの執務室に連行されます。スカルピアは、トスカを執務室に呼び、カヴァラドッシの拷問をトスカに見せます。耐えられなくなったトスカはアンジェロッティの隠れ家を白状します。カヴァラドッシは投獄され、彼を助けるためにトスカはスカルピアに身をまかせなければなりません。一度はやむなく承諾しますが、ふと目にとまったナイフでスカルピアを刺し殺してしまいます。殺害する寸前にスカルピアに書かせた通行証明書を手に、トスカはカヴァラドッシを救いに行きます。護送されたカヴァラドッシのいる聖アンジェロ城へ駆けつけるトスカ。カヴァラドッシは、事前にトスカの懇願によるスカルピアの計らいで、空砲による見せ掛けの死刑になるところ、スカルピアの巧妙な陰謀によって、実弾で本当に銃殺されてしまいます。それを見て逆上したトスカは、スカルピア殺害が判明し追いかけてきた警官達を振り切り、城砦の上からテヴェレ川へと身を投げるのでした。